Kozarec Longy

Ispitivanje efekata medijuma tretiranog proizvodima “Natura”, “Longy” i “Cev”na proliferaciju i učestalost mikronukleusa humanih limfocita in vitro CBMN testom

Uvod: Citohalazin –blok mikronukleus test (CBMN) test je jednostavan i osetljiv test za in vitro i in vivo procenu genotoksičnih svojstava različitih jedinjenja, i preporučen je od strane Organizacije za ekonomsku saradnju i razvoj (OECD) i Medjunarodne atomske agencije (IAEA). Mikronukleusi su mala jedra koja nastaju kao posledica prisutva nestabilnih hromozomskih aberacija - hromozomsksih fragmenata, indukovanih dejstvom agenasa koji dovode do DNK prekida. Neuspešna reparacije DNK prekida dovodi do formiranja mikronukleusa. Mikronukleusi mogu u sebi sadržati i čitave hromozome, ne samo fragmente, ukoliko su nastale promene u proteinskoj strukturi hromozoma te centromere nisu dovoljno istaknute da bi se pravilno vezale za niti deobnog vretena. Povećanje učestalosti mikronukleusa je biomarker izloženosti genotoksičnim agensima. Test daje i podatke o proliferativnom potencijalu kultuvisanih limfocita analizom udela mononukleusnih, binukleusnih I polinukleusnih ćelija korišćenjem formule Fenech et al 2006, Surrales et al 2007. Zbog svoje pouzdanosti I reproducibilnosti CBMN test je postao najčešće korišćen test za procenu izloženosti genotoksičnim agensima u random okruženju, životnoj sredini ili kao posledica životnog stila.

Eksperimenatlni dizajn:U ovom izveštaju predstavljeni su rezultati ispitivanja efekata tri proizvoda: “Natura”, “Longy” I “Cev”, kojima je tretiran hranljivi medijum za kultivisanje limfocita in vitro (PBmax karyotyping medium GibcoTM (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12557013), koji sadrži 90% vode, 5% fetal-bovin seruma , 2% fitohemaglutinina, optimizovanu koncentraciju minerala sličnih mineralima u krvnoj plazmi i glukozu. Ekspriment je postavljen sa ciljem da se proceni efekat najzastupljenije komponente medijuma- vode u ova tri tretmana.

Posude “Natura” “Longy” I “Cev” oprane su miliQ vodom, osušene i sterilisane u suvom sterilizatoru 1h na 120oC. Zatim je Pbmax kariotyping medijum tretiran svakim poroizvodom pojedinačno 10 minuta i alikvotiran u sterilne epruvete za kultivaciju (Slika 1). Zapaža se vrlo blaga promena pH medijuma od 7 (kontrola) do 7,4 (cev)Longy1

Na slici 2 prikazane su kulture limfocita: alikvoti pune krvi (0,5 mL su zasadjeni u svaku epruvetu. Za isptivanje korišćena su 2 uzorka krvi dobrovoljnih davaoca, muški donori, starosti 32 godine.

Ispitivani su:

  1. Kontrolni uzorak u medijumu koji nije tretiran.
  2. Uzorak u medijumu tretiran proizvodom Natura
  3. Uzorak u medijumu tertian proizvodom Natura kome je dodato 50% netretiranog medijuma
  4. Uzorak u medijumu tretiran proizvodom Longy
  5. Uzorak u medijumu tretiran proizvodom Longy kome je dodato 50% netretiranog medijuma
  6. Uzorak u medijumu tretiran proizvodom Cev
  7. Uzorak u medijumu tretiran proizvodom Cev kome je dodato 50% netretiranog medijuma

Nakon 48h kultivacije u inkubatoru na 37oC , uzeto je 5µL za krvni razmaz radi ispitivanja eritrocitne morfologije. Nakon toga svim kulturama je dodat Cytohalazin B u finalnoj koncentraciji 2µg/mL. Kultivacija limfocita je nastavljena naredna 24h (po standardnom protokolu). Citohalazin blokira citokinezu plazma membrane, ali ne remeti procese u ćeliji. Sve ćelije koje su prošle prvu deobu postaju binukleusne, sa dva jedra oivičene jednom plazma membranom. Ćelije koje nisu dospele do prve deobe ostaju sa jednim jedrom-mononukleusne, one koje su prošle 2 deobe imaju po 3 ili 4 nukleusa oivičene jednom membranom-polinukleusne ćelije. Mikronukleusi se analiziraju samo u binukleusnim ćelijama, a medjusobni odnos mono, bi i polinukleusnih ćelija daje proliferativni indeks.

Rezultati:

Morfologija eritrocita prikazana je na Slici 3: (kontrola, natura, Longy i cev)

Longy_slika3

Kontrola i „Natura“ pokazuju identične morfološke oblike eritrociita sa karakterističnim oblikom bikonkavnog sočiva (beličasta sredina ćelije). „Longy“ sadrži više eritrocita sa saturisanim hemoglobinom, dok „cev“ menja oblik eritrocita i u malom procentu eritrociti zadržavaju oblik bikonkavnog sočiva. Nijedan tretman ne dovodi do promene naelektrisanja i provodljivosti eritrocitne membrane, jer nazubljene ćelije („crenated Er“) nisu uočeni.

Rezulatati CBMN testa:

Učestalost mikronukleusa i indeks proliferacije prikazani su na Slici 4:

Longy_slika4

Slika 4: Učestalost mikronukleusa u BN ćelijama i proliferativni indeks

Tretman proizvodom „Natura“ smanjuje učestalost mikronukleusa za 45%, i 46% što je praćeno i smanjenjem proliferativnog indeksa za 17,8%.
Tretman proizvodom „Longy“ su potpuno eliminisale ćelije koje u sebi nose oštećenja iz kojih se generišu mikronukleusi. Učestalost mikronukleusa je nula, i takodje je praćeno smanjenjem proliferativnog indeksa za 17,8%. Tretman proizvodom „Longy“ u razblaženoj koncentraciji, sa 50% medijuma koji nije tretiran smanjuje učestalost mikronukleusa za 72% uz vrlo blago smanjenje proliferativnog potencijala (7,27%).

Tretman proizvodom „Cev“ takodje smanjuje učestalost mikronukleusa (75%) ali uz značajno smanjenje proliferacije što se interpretira kao citostaza. Razblaženi medijum tretiran proizvodom „Cev“ snižava učestalost mikronukleusa za 33% i oporavlja proliferaciju ćelija.

Analizom svih navedenih parametara može se zaključiti:

Proizvod „Natura“ blagotvorno deluje na humane ćelije in vitro, smanjuje stepen spontano nastalih mikronukleusa za 45%, blago usporavajući njihov rast, i ne remeti morfologiju eritrocita.

Proizvod Longy potpuno eliminiše ćelije koje u svom genetičkom materijalu nose dvolančane ili jednolančane prekide DNK, koji bi neuspešnom reparacijom generisale mikronukleuse. Smatra se da se ovakav efekat ostvaruje aktiviranjem mitohondrija, odvajanjem citohroma C od mitohondrijalne membrane što indukuje apoptozu. Iako mehanizam dejstva tretmana Longy tek treba ispitati, najverovatnije je da je u pitanju indukcija apotoze - fiziološkog mehanizma eliminacije oštećenih ćelija, toksina bez zapaljenja. Eritrocitna morfologija je sačuvana ali je uočljiva saturacija hemoglobina što takodje treba dalje ispitivati.

Proizvod „Cev“ dovodi do citostaze, kruni sitne čestice jednake velične iste morfologije, ne pokazuje protektivna svojstva.

Kod svih navedenih ispitivanja treba uzeti u obzir da su obavljena na humanim ćelijama in vitro. Eksperiment je uradjen 2 puta u Laboratoriji za medicinsku biohemiju-Centru za citogenetiku Genmedica i dobijeni su reproducibilni rezultati.

dr sc Gordana Joksić,

molekularni biolog, genetičar, naučni savetnik

Kozarec Longy za daljše življenje